引言
昆蟲可以綜合多種感官線索在環(huán)境中進行導航，以找到合適的食物來源、交配伙伴或產(chǎn)卵地點。要了解昆蟲在多變的嗅覺環(huán)境中的飛行行為，需要一個三維空間詳細分析其飛行行為。本研究將介紹在三維環(huán)境中跟蹤Anopheles gambiae sensu lato蚊子的飛行，分析在嚴格控制的氣候條件下蚊子對人類釋放的體味和二氧化碳的宿主尋找行為。
根據(jù)過往研究和觀察，雌性嗜人血蚊子對人類宿主氣味的遠程飛行策略是，蚊子在接觸到帶有氣味的空氣后會向上風方向飛行，如果蹤跡消失，則會進行橫風飛行。在中等距離，蚊子受到人類釋放二氧化碳和體味的影響，會使用高對比度的視覺特征，并在存在短距離宿主線索（如體溫和濕度）的情況下開始著陸。雖然這些基本特征是所有尋找宿主的蚊子物種所共有的，但在各自感官線索的相對重要性，可能因宿主偏好和日常飛行活動模式等有所不同。
材料與方法
風洞系統(tǒng)
研究所使用的風洞系統(tǒng)如圖1所示。從氣候室到預備室和飛行區(qū)域，空氣要經(jīng)過一個均衡器，其中氣流的溫度、濕度和速度變化都會得到穩(wěn)定（圖1A）。在預備室內(nèi)，可以通過引入氣味源等方法操縱流向飛行區(qū)域的氣流。
在上述風洞裝置中跟蹤蚊子的飛行行為。風洞溫度調(diào)整為 27.0°C，相對濕度為 70%，風速設定為 0.22 m s-1。
氣味刺激
氣味刺激由放置在風洞系統(tǒng)預備室中的兩個不同裝置（玻璃環(huán)和金屬襪子架）提供（圖2A、B）。不同濃度的二氧化碳通過一個等距開孔的玻璃環(huán)產(chǎn)生氣流。人類體味則采用實驗者穿過的襪子：在實驗前19-21小時穿上黑色棉襪，將其卷起，然后懸掛在金屬鉤上。穿過的襪子可提供最多1小時的氣味源，之后用洗滌劑清洗后再重復使用。
研究一中的氣味刺激是空氣或1,200 ppm二氧化碳與人腳氣味或相應對照組（即無襪子和干凈襪子）的組合。由此產(chǎn)生的處理組合為 “空氣/空氣"、“二氧化碳/空氣"、“空氣/干凈的襪子"、“空氣/使用過的襪子"和“二氧化碳/使用過的襪子"。在研究二中，二氧化碳本身的濃度為環(huán)境濃度（400 ppm 至 445 ppm）或高濃度（1,200、2,400、4,800 ppm）。
實驗程序
本研究使用的蚊子為Anopheles gambiae sensu lato蚊子。在每次試驗中，裝有一只雌蚊的釋放籠被放置在釋放點。蚊子經(jīng)過2分鐘的適應期后，開始錄像，并打開釋放籠的門。在3分鐘內(nèi)未進入拍攝的飛行區(qū)域（圖2A，灰色區(qū)域）的蚊子將被剔除，不再做進一步分析。記錄有反應的蚊子飛行行為，直到它們在上風屏上著陸至少5秒，或連續(xù)飛行長達10分鐘。每次試驗后，目測蚊子的反應（“飛行"、“不飛行"）和著陸地點（“上風屏"、“其他"、“未著陸"）。每只蚊子只測試一次。
視頻追蹤和飛行軌跡重建
使用諾達思的多視頻錄制軟件(Media Recorder)以60幀/秒的速度從風洞上方用兩臺紅外光敏感GigE攝像機（圖2A）記錄飛行行為。六個紅外陣列提供照明，放置在飛行區(qū)域的下風端。在風洞的上風端，有一個LED 陣列，提供低強度的漫射可見白光，用于蚊子的視覺定向。相機以一定角度安裝在風洞上方。
諾達思的動物運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)用于將兩臺攝像機的視頻文件轉(zhuǎn)換為二維位置數(shù)據(jù)。使用諾達思的三維運動軌跡跟蹤系統(tǒng)(Track3D)將二維位置數(shù)據(jù)合并為三維飛行軌跡。以下變量由Track3D計算并用于后續(xù)分析：三維位置（x、y、z）、飛行速度和垂直面航向角。
研究結(jié)果
研究一——人類宿主
在447只接受測試的蚊子中，有161只在打開籠門后3分鐘內(nèi)做出反應，進入拍攝區(qū)域。人類宿主對蚊子的反應數(shù)量有顯著影響，其中二氧化碳和人類腳味這兩個因素以及它們之間的相互作用對觀察到的影響有顯著作用。與所有其他處理相比，同時暴露于二氧化碳和人腳味時，有更大比例的蚊子（約70%）進入拍攝區(qū)域（圖3A）。其他處理之間沒有明顯差異。
當存在人類宿主線索時，蚊子在研究設定的感興趣體積（VOI）內(nèi)飛行的比例較大（圖3B）。二氧化碳和人腳氣味的組合誘發(fā)蚊子在VOI內(nèi)飛行的比例最高。與空氣對照組相比，單獨的人腳氣味會導致在VOI內(nèi)的飛行顯著增加，而空氣對照組與清潔襪子對照組之間沒有差異。
在分析至少接觸過一次VOI的蚊子的平均橫風飛行速度時（圖3C），發(fā)現(xiàn)人腳氣味和空氣對照的組合與清潔襪子控制之間存在顯著差異。與空氣對照組相比，接觸二氧化碳和人腳氣味的蚊子平均飛行速度快1.3倍。
在161只蚊子中，有108只在10分鐘的最長記錄時間內(nèi)著陸。不同處理之間沒有明顯差異（圖3D）。然而，蚊子落在目標區(qū)域的比例受到二氧化碳和人腳氣味因素的顯著影響，在二氧化碳和人腳氣味的作用下，57%的蚊子落在上風屏上的目標區(qū)域，而空氣和清潔襪子對照分別為3%和10%。這些差異在不同處理間有顯著性差異（圖3D、E）。
研究二——二氧化碳
在研究二中，235只蚊子有107只進入了拍攝區(qū)域。未觀察到二氧化碳濃度的顯著影響。未觀察到二氧化碳濃度對VOI內(nèi)飛行比例的影響。VOI內(nèi)的飛行比例普遍較低，從1200 ppm的0.2%到2400 ppm的2.9%不等。在比較兩種處理方法時，沒有觀察到橫風飛行速度的顯著差異。兩種處理之間沒有橫風飛行頻率增加的趨勢。在10分鐘的最長記錄時間內(nèi)，101只蚊子中有77只落下。沒有觀察到蚊子降落的總比例有顯著差異，也沒有觀察到落在目標區(qū)域的蚊子比例。
討論
本文的研究展示了在風洞系統(tǒng)中運用三維軌跡分析蚊子飛行的實驗研究。在本研究中，當人類腳味和二氧化碳結(jié)合在一起時，蚊子的橫風飛行速度更快，在氣味流中停留的時間更長，并更成功地鎖定氣味源。相比之下，雌性Anopheles gambiae sensu lato蚊子在不同濃度的二氧化碳作用下，并沒有表現(xiàn)出尋找宿主的行為。這些觀察結(jié)果支持了之前關于人類宿主相關線索在宿主尋找中過程中作用的研究結(jié)果，并證實了二氧化碳不是單獨的宿主尋找線索。本文為未來不同環(huán)境下研究昆蟲三維空間飛行行為提供了方法。
參考文獻
Hinze, Annika, et al. “Mosquito host seeking in 3D using a versatile climate-controlled wind tunnel system." Frontiers in Behavioral Neuroscience 15 (2021): 643693.
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